Etablierung der Erstellung von cDNA-Libraries f ¨ ur Illumina Sequenzierung (RNAseq) von Prokaryotischer total RNA


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Uwe.John [ at ] awi.de

Abstract

Heutzutage ist das ”High-troughput sequenzing” eine unverzichtbare Standardmethode zur Messung des RNA-Expressionsniveaus (RNAseq) in fast jedem Life-Science-Labor. Die RNAseq-Technologie erm¨oglicht die detaillierte Identifizierung von Gen-Isoformen, Translokationsereignissen, Nukleotidvariationen und post-transkriptionellen Basenmodifikationen. Im Gegensatz zum eukaryontischen Organismus haben Prokaryonten keinen Mechanismus, um Messenger-RNAs (mRNA) von ribosomalen RNAs (rRNA) vollst¨andig zu unterscheiden. Aufgrund des fehlenden Polyadenylierungsschrittes und des damit verbundenen Fehlens eines sogenannten Poly(A)- Schweifs k¨onnen die meisten der g¨angigen Techniken und Extraktions-Kits nicht auf prokaryontischen Organismen angewandt werden bzw. Sie wirken nur eingeschr¨ankt oder gar nicht. Dass ist der Grund, warum die Entfernung der ribosomalen RNA ein sehr wichtiger und kritischer Schritt in der Produktion von cDNA ist, die ihrerseits die Grundlage f ¨ ur die RNASequenzierung dar stellt. Dies inspirierte mich dazu, eine neue Methode auf Basis des ”Ovation ® Complete Prokaryotic RNA-Seq DR Multiplex Systems 1-8 und 9-16” von NuGEN (Kalifornien, USA) zu etablieren, um cDNA-Bibliotheken f ¨ ur die RNA Sequenzierung aus prokaryotischer Total- RNA herzustellen. Dabei wurden jedoch die ribosomalen RNAs nicht wie ¨ ublich vorab aus den Gesamt-RNA-Pool entfernt. Stattdessen wurde das Kit direkt auf die gesamte Isolierte RNA angewandt, da durch die Verwendung einer selektiven Primertechnik das Kit eigenst¨andig nach Aussage des Herstellers die Replizierung der st ¨orenden ribosomalen RNA unterbindet. F¨ ur diese Arbeit wurden die Probenpools aus zwei unterschiedlichen Experimenten verwendet: Synechococcus sp.[Hell-Dunkel-Experiment; CAN] und Microcystis aeruginosa[CO2+Temp; NLD]. DesWeiteren wurde ein Teil derMicrocystis aeruginosa-Bibliotheken sowohl regul¨ar als auch mit einem modifiziert Primerpool hergestellt. Dieser wurde speziell auf Basis des Microcystis aeruginosa-Genoms entwickelt und enthielt nur Primer, die mit der rRNA des Organismus inkompatibel sind und somit, das selektive Primering- Verfahren weiter optimieren k¨onnte.Neben einer Gegen¨ uberstellung von Ausgangs-RNA und der finalen cDNA-Bibliotheken wurden Letztrige auf ihre Kompartibilit¨at mit der entsprechenden ribosomalen RNA im Rahmen einer RNA Sequenzierung getestet. Die Messergebnisse wurden abschließend mit der rRNA Aufreinigungs-Effizienz von drei weitern, extra f ¨ ur die Entferung von rRNA aus total RNA entwickelten, Kits verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Methode sich generell f ¨ ur die Erstellung von cDNA-Bibliotheken aus prokaryontischen Gesamt-RNA-Proben eignet. Jedoch zeigte die RNA Sequenzierung, dass die Effizienz bezogen auf die Entfernung der rRNA deutlich unterhalb der anderen Kits lag. Des Weiteren waren die Qualit¨at und Reinheit der endg¨ ultigen Bibliothekspools nicht hoch genug, um einen positiven Effekt des modifizierten Primerpools zu belegen. Nichtsdestotrotz w¨ urde ich die Verwendung des ”Ovation ® Complete Prokaryotic RNA-Seq DR Multiplex Systems 1-8 und 9-16” von NuGEN zur Anfertigung von cDNA Bibliotheken aus prokaryontischen Organismen durch aus als eine alternative Methoden empfehlen. Zudem konnte nicht gezeigt werden, ob eine zus¨atzliche Investition in einen spezifischeren Primerpool vorteilhaft is und m¨ usste in weiteren Experimenten nachgewiesen werden.



Item Type
Thesis (Bachelor)
Authors
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Primary Division
Programs
Primary Topic
Peer revision
Not peer-reviewed
Publication Status
Published
Eprint ID
53675
Cite as
Pechstein, N. (2019): Etablierung der Erstellung von cDNA-Libraries f ¨ ur Illumina Sequenzierung (RNAseq) von Prokaryotischer total RNA , Bachelor thesis, Hochschule Bremerhaven.


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